【过氧化氢酶检测】 [原创]

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实验简介

过氧化氢酶(CAT),是催化过氧化氢分解成氧和水的酶,存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中,特别在肝脏中以高浓度存在。  过氧化氢酶的活性也可以用紫外分光光度计测定A240,但蛋白质或其它组份在A240附近都有比较强的吸收,会对测定产生严重干扰。因此,用紫外法测定过氧化氢酶的活性,比较适合纯化的过氧化氢酶。本试剂盒通过检测A520来测定过氧化物酶催化下由过氧化氢氧化生色底物产生的红色产物,受干扰的因素小,检测灵敏度高,可以检测出低达1U/ml的过氧化氢酶。

参考文献


                        

实验原理

在过氧化氢相对比较充足的情况下,过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气。残余的过氧化氢在过氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物,产生红色的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-benzoquinonemonoimine),最大吸收波长为520nm。用过氧化氢标准品,制作标准曲线,这样就可以计算出样品中的过氧化氢酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气,从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力。

安全性


                                            

主要试剂/材料

酶标仪 1
恒温培养箱 1
移液枪 若干
96孔板 若干

【过氧化氢酶检测】的实验步骤

第1步

(1)试剂组成:试剂购于碧云天。
试剂一:过氧化氢酶检测缓冲液,60ml
试剂二:过氧化氢 (约1M),5ml
试剂三:过氧化氢酶反应终止液,50ml
试剂四:显色底物,20ml
试剂五:过氧化物酶,20μl
(2)试剂配制:
A、配制250mM过氧化氢溶液。本试剂盒提供的过氧化氢浓度约为1M。由于过氧化氢不是非常稳定,使用前需自行测定过氧化氢的实际浓度。把浓度约为1M的过氧化氢用本试剂盒提供的过氧化氢酶检测缓冲液稀释100倍,使过氧化氢的浓度约为10mM。测定A240。过氧化氢浓度(mM)=22.94 X A240
从而计算出本试剂盒提供的过氧化氢的实际浓度。然后再根据实际的过氧化氢浓度配制250mM过氧化氢溶液。

B、配制5mM过氧化氢溶液。根据测定得到的实际过氧化氢浓度配制5mM过氧化氢溶液。
C、 配制显色工作液。在冰浴上溶解显色底物,适当分装后再使用,尽量避免反复冻融。其它试剂放置在冰浴上备用。取适当量的过氧化物酶,按照1:1000的比例用显色底物稀释,配制成显色工作液。例如取5μl过氧化物酶,加入5ml显色底物,混匀即得到5ml显色工作液。

第2步

标准曲线测定:
a.  取0、12.5、25、50或75微升配制好的5mM过氧化氢溶液至1.5ml或0.5ml塑料离心管中,分别加入过氧化氢酶检测缓冲液至最后体积为100微升,混匀。
b.  各取4微升,加入到96孔板中的一个孔内。加入200μl显色工作液。25℃至少孵育15分钟后测定A520,但孵育时间不宜超过45分钟。(注:本步骤可以和样品测定步骤中的最后一步同时进行。)

第3步

样品测定:测定前要做预实验,OD值不能太低,一般要看见明显的红色。
如图:
a.  参考图,取x微升(0-44微升)样品至96孔板中,加入过氧化氢酶检测缓冲液至体积为44微升(即加入44-x微升过氧化氢酶检测缓冲液),混匀。再加入6微升250mM过氧化氢溶液,用振荡器迅速混匀。,25℃反应1-5分钟。
b.  加入250微升过氧化氢酶反应终止液,用振荡器混匀以终止反应。需在终止反应后15分钟内完成下面的步骤c和步骤d。
c.  在一洁净的96孔板中加入80微升过氧化氢酶检测缓冲液,再加入20微升已终止并混匀的上述反应体系,混匀。
d.  从上一步骤的80微升体系中取10微升加入到96孔板中的一个孔内。加入200微升显色工作液。
e.  25℃至少孵育15分钟后测定A520,但孵育时间不宜超过45分钟。

第4步

样品中过氧化氢酶酶活力的计算:过氧化氢酶酶活力单位的定义:1个酶活力单位(1 unit)在25℃,pH7.0的条件下,在1分钟内可以催化分解1微摩尔过氧化氢。
a.  计算出标准曲线。此处以OD值为X轴,过氧化氢量(uM)为为Y轴,这里的过氧化氢的量需要计算。将OD值代入标准曲线,得到到值为残余过氧化氢量,因为过氧化氢酶作用下消化了一些过氧化氢,剩下显色的为残余过氧化氢。

b1. 对于细胞或组织样品的过氧化氢酶活力计算:
[样品过氧化氢酶酶活力]=[消耗过氧化氢微摩尔数] X[稀释倍数]/([反应分钟数]X[样品体积] X [蛋白浓度]) 
[消耗过氧化氢微摩尔数]=[空白对照残余过氧化氢微摩尔数]-[样品残余过氧化氢微摩尔数]
[样品过氧化氢酶酶活力]的单位为units/mgprot
 [稀释倍数]=250,
 [反应分钟数]即为实际的反应分钟数
[样品体积]为表2中的X微升,以毫升来表示即为X/1000毫升。
[蛋白浓度]为取X微升样品时,样品中的蛋白浓度,单位为mg/ml。
b2.	对于血浆等液体样品的过氧化氢酶活力计算:
[样品过氧化氢酶酶活力]=[消耗过氧化氢微摩尔数] X[稀释倍数]/([反应分钟数]X[样品体积])
[样品过氧化氢酶酶活力]的单位为units/ml样品

实验结果

图为血清中过氧化氢酶活性数据。

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