【琼脂糖凝胶电泳实验】 [原创]

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实验简介

琼脂糖(Agarose)凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。

参考文献


                        

实验原理

DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA。
溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察,可检测到5 ng以上的DNA。

安全性


                                            

主要试剂/材料

电泳仪 1
凝胶成像系统 1
TBE 5X 1
EB 1
电泳槽 1
琼脂糖 1

【琼脂糖凝胶电泳实验】的实验步骤

第1步

制胶
(1) 根据待测DNA大小配制不同浓度的琼脂糖(0.5%:1-30 kb;0.7%: 0.8-12 kb;1.2%:0.4-7 kb;1.5%:  0.2-3 kb),我们将以1%的琼脂糖作为例子。
(2)称取0.2 g 琼脂糖,放到一锥形瓶中,加入20 ml 0.5×TBE电泳缓冲液。微波炉加热,至琼脂糖完全溶解(防止溢出)。
(3)将制胶板放入制胶槽中,插入适当的梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃)加入2ul EB后,混均匀,倒入其中,直至厚度为4~6 mm(如有气泡要把气泡赶出),在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)。
(4)将制胶板置于电泳槽中,小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好。

第2步

点样:
(1)在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面
(2)把待检测的样品,按以下量在洁净载玻片上小心混匀,用移液枪加至凝胶的加样孔中。加样量为: 1μl加样缓冲液(6×)+5μl待测DNA样品。选一个加样孔加同样的DNA mark。

第3步

电泳:
接通电泳仪和电泳槽,调节电压至3~5 V/cm(约100 V),开始电泳。点样端放阴极端。观察溴酚兰的带(蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处,可停止电泳(大约半个小时左右)

第4步

观察结果:
在凝胶成像系统下观察电泳结果。

实验结果

图为PCR产物琼脂糖凝胶电泳。

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